Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

Cromatografía de Líquida de Alta Eficiencia

(High Performance Liquid Chromatography)

Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

* Tipos de Cromatografía Líquida
o

Cromatografía de Partición.
*

Cromatografía de Adsorción
*

Cromatografía Iónica
* Cromatografía de Exclusión

Diagrama Básico de un sistema de HPLC

* Eleccción del Solvente

Características:
o

Disponible comercialmente
*

Precio
*

Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impuresas.
*

Disolver la muestra
*

Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
*

No degradar o disolver la fase estacionaria
*

Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
* Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)Filtración y Desgasificación de solventes
o
+
#

Filtro a la Entrada del Solvente

Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC :

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Técnicas del Laborario Moderno más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos. Como en todas las técnicas analíticas, los pequeños problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolución de los cromatografos líquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que ésta no puede resolver.

Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fábrica, pueden acumular partículas en suspención que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partículas en suspención pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposición al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depósito para solvente, la exposición a partículates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depósito del solvente, la degradación lenta del recipiente solvente, o de condensación y polimerización del solvente. Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmósfera. El trasegado del solvente en el depósito solvente y su almacenamiento en estos depósitos máseste fenómeno. El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.
*

Filtración al Vacío
* Filtración en Línea
Sonificación

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:
*

Burbujear Helio
*

Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
* Desgasificación al Vacío en LíneaBombas

Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:
o

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
*

Mantener el flujo libre de pulsaciones
*

Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
*

Control y reproducibilidad del flujo de solvente
* Componentes de la bomba resistentes a la corrosiónLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
o

Mecánicas
+

Recíprocantes
*

De desplazamiento contínuo
o Neumáticas

Programación del Solvente

Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:
o Isocrático

*
o

Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
+

A baja presión
* A alta presión
o
+

Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos objetivos:
* Asegurar alta presición y exactitud.
o
+

Determinar la composición inicial y final del solvente

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasos fundamentales:
*

Ajustar el tiempo del gradiente
*

Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
*

Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusión
* Regresar a las condiciones iniciales la columna.Sistemas de Inyección de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vávulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna:
Fuentes de daño de una columna de HPLC:

* Obstrucción por partículas pequeñas en los solventes o fases móviles
* Obstrucción por materiales no eluídos en las muestras
* Variación de las características de retención por incremento de materiales no eluídos

Detección

La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como también de lascaracterísticas de las señal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
o

Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
* Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector UltravioletaLos detectores más utillizados en HPLC son:
o

Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
+

Detector de Longitud de Onda Fija
*

Detector de Longitud de Onda Variable
*

Detector de Arreglo de Diodos
o

Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:
+

Tipo Deflexión
*

Tipo Fresnel
o

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización .
*

Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
o
+

Según la Fuente de Excitanción
*

Según el sistema óptico
o

Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
+

Detector Amperométrico
*

Detector Conductimétrico
*

Detector Potenciométrico

Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis reproducicbles:
o
+
#

Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador.
*

Usar bombas reciprocantes de doble piston
*

Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector.
*

Operar con el voltaje adecuado
*

Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos.
*

Tener electrodos de referencias extras en solución 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 ó 2 veces a la semana.
*

Desconectar el detector electroquímico cuando este llimpiando las columnas.
* Utilizar agua, buffers y solventes orgánicos de alta pureza.Derivatización

Existen dos tendencias :
o

Pre-Columna
* PostColumnaAnalisis Cualitativo y Cuantitativo

Problemas más comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cómo solucionarlos.
o

Presión Alta
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si ésto no funciona reemplaze el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplaze la columna.
*

Solución a largo plazo: Asegurese que todas las fases móviles se filtren apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
o

Pérdida de la Resolución
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: vea la sección de Presión Alta
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Picos Hendidos
+

Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Marcha atrás columna roja con presión baja está al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna.
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Variación en los Tiempos de Retención
+

Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil.
*

Solución: Bomba primera y está fases seguras tan móviles es propiamente [degassed]
*

Solución a larga plazo: Asegurese fase tan móvil está propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en línea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing] completo.
o

Variaciones de la Línea Base
+

Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de la fase móvil.
*

Solución: Asegurese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.
o

Línea Base con mucho Ruido
+

Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
*

Solución: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase movil del sistema.
o

Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)
+

Posible causa: Oxígeno Disuelto
*

Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto.
*

Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto.
o

Baja ó Ninguna Presión
+

Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspención en la fase móvil.
* Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus necesidades:
o

Cuántas muestras y tipos de ensayos
*

La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento)
*

La exactitudad y presición del sistema de bombas
*

El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
*

Que tipo de servicio ofrecen ó puede ofrece la casa vendedora
*

Suministro de software y compatibilidades
* Cuánto puede PAGAR usted !

108 pensamientos en “Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)”

  1. Administrador, podrías quitar por favor mis comentarios, sonaba super egolatra jejeje pero ya tuve mi despertar espiritual, asi que te ruego eliminar mis comentarios, seguiré aprendiendo de todos uds xq no lo se todo y siempre abra alguien que sepa mas que yo jejeje, saludos a todos. PD. Ex PACHE

  2. Hola! Uso una columna C18 para identificar hidrazonas, pero la presión al mismo flujo (5ml/min) ha incrementado notablemente de 300 psi a 800 psi, he estado lavando con agua 100% y ACN 100% pero este problema no se corrige. Me parece que algo precipitó o está tapando el flujo ¿Podrían ayudarme?

    1. Doy respuestas hasta por correo y ni así se dignan a decir gracias, me reuso al maltrato jumm jummm, lo peor es q se las respuestas asssshhh…

  3. Hola me gustaria saber si conocen algun metodo para determinar acidos organicos como ac. acetico, acido butirico y citrico por hplc- uv. Graciass

  4. Hola, por favor alguien que me comparta como realizar lactosa y perfil de acidos grasos por HPLC detector UV-VIS es mega urgente!!!! veo que `Pache conoce mucho de HPLC se los agradecería mucho.

  5. Hola!
    tengo una duda que me gustaría que me resolvieras, tengo que hacer una determinación de paracetamol y cafeína en orina por HPLC-UV y me gustaría saber si tengo que hacerle algún tipo de tratamiento especial antes a la orina.
    Muchas gracias.

    1. Yo considero que por el tipo de muestra que se trata (biológico) debes de centrifugar para separar los sólidos de la muestra y ahora sí preparar la muestra ó en su defecto filtrarla para que el resto de los componentes de la orina no interfieran en la determinación que pretendes realizar, gracias, si encuentras alguna otra alternativa te agradezco que la compartas Patricia.

    1. no solo le salen hongo, también se acumulan partículas que te pueden taponar tanto las tuberías y las columnas. no uses por más de 24 horas, la misma agua.

  6. Saludos.
    me pareció muy interesante ésta página, recien estoy realizando mis primeros pasos en cromatografía, estoy acutalmente trabajando con glifosato, me podrían ayudar?

  7. 1. Aspectos fisiologicos (absorción, distribución, metabolización y eliminación) de Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    2.Incompatibilidad farmacologica Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    3.Incompatibilidades físicas y químicas Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    4. Morfologia de Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

  8. estamos haciendo pruebas con ibuprofeno ergotamina y cafeina, HPLC detector uV, alguna idea de condiciones y columnas (l7 o L1) para determinar los 3 activos con la misma tecnica? juro q te estare muy agradecida

    1. Probá con una L7 x 30 cm, luego un flujo de 1ml/min, programá cambios de long. de onda durante la corrida adecuados a cada compuesto. En USP hay para ergotamina y cafeina tablets, pero no hay asociación con Ibuprofeno; te recomiendo un mix de ambas técnicas.

      1. Jajaja de nada ;) oye ya que andamos en el tema, la verdad es q lo mio es el HPLC use UV hace mucho tiempo, tu abras hecho pruebas antioxidantes por UV? me ayudas con unos cálculos de FRAP, gracias.

    1. Las columnas debén lavarse siempre con agua90:metanol10 (o solo con agua), pero si no van a utilizarse durante un largo período deben guardarse (lavarse) con una mezcla de agua/solvente utilizada en la técnica a fin de evitar crecimiento bacteriano, secado de la silica (silenoles), eliminar impurezas no eliminadas con el simple paso de la fase móvil, evitar la precipitación de sales existentes en la fase móvil, etc.
      Ej. Agua25:metanol75 (si la fase orgánica de la muestra tiene metanol)
      Agua50:Acetonitrilo50 (si la fase orgánica de la muestra tiene Acetonitrilo)
      Sc Cloruro de sodio 90mM 90%:Metanol 10% (generalmente para columnas de exclusión molecular)

    1. Te comento mi experiencia. Yo solo utilizo volumen muerto cuando quiero limpiar todo el sistema HPLC, pero si mi método me pide analizar impurezas o me pide calculo de señal ruido lo hago obligatoriamente para eliminar cualquier aparicion de picos fantasma en mi cromatograma, ya que generalmente los picos a determinar son pequeños como 5 mAU o 1 de altura. Es por ello que me piden ademas calculo señal ruido.

    2. Las uniones de volumen son solo eso, uniones, se utilizan generalmente para técnicas que utilizan 2 columnas en serie (ya que no se cuenta con una sola lo suficientemente larga), o una pre-columna, la razón es para unirlas sin incrementar la difusión de la muestra durante el pasaje de la muestra de una columna a otra.

    1. Es importante lavar las columnas despues de su uso pues la muestra puede interaccionar con la base de la columna y taparla o alterarla quimicamente, pero no tiene que ser tan “estricto” yo he dejado una columna por la tarde ya la lavo al siguente día temprano.
      Tambien ahi una bombas de lavado de columna que puedes dejar toda la noche a flujo bajos (0.2mL/min) y recuerda cada columna se lava y almacena diferente ;) suerte ojala comentes o juro que dejare este foro :(

    1. No se malogra, lo que puede pasar es que puedas deteriorar la silica de la columna, si utilizar una fase movil con par ionico podria ocurrir obstruccion de tu columna. Esta no puede quedar detenida por mucho tiempo, un experto me dijo que es mejor dejarla a flujo pequeño de 0.1mL. Es muy importante el lavado y lavar mejor antes que pase un dia sin que este lavada tu columna.

  9. Que tipo de detector?
    Puedes usar una GRACE o ZOrbax SB de 15 cm FM hexanosulfonato de sodio-HAC-MeOH
    a 270nm y checa cual de las el complejo B porque son un chorro.
    Saludos

  10. Hola, trabajo en la supervisión de calidad de la miel, quisiera saber si alguien conoce un método para la determinación de antibioticos como estreptomicina y sulfonamidas por HPLC?. Le agradezco su ayuda. Me urge!!!!!

    1. UV 340nm columna Lichropher C18 (25 cm x 4.6 mm y 5 µm), FM ácido oxálico 0.13%:acetonitrilo: metanol (60:30:10 v/v/v), flujo fue 1.0 mL/min. Pruebalo y me cuentas, pero me cuentas he siempre dejo respuestas y nadie comparte.

  11. pero en que consiste el detector de indice de refraccion tipo fresnel porque aca solo esta mencionado pero no indican su funcion sus ventajas y desventajas

Puedes decir algo sobre la entrada actual…

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